Produksi dan karakterisasi biokimia lakase jamur tiram NRC 620 serta evaluasi efisiensinya dalam penjernihan jus apel.

Setelah 25 hari inkubasi statis pada suhu 28°C, lakase dari *Pleurotus ostreatus* NRC620 menunjukkan aktivitas tertinggi dalam media kultur jamur. Nilai pH dan suhu optimal untuk enzim ini masing-masing adalah 3,0 dan 70°C. Setelah 2 jam inkubasi pada suhu 40°C dan 50°C, aktivitas enzim tetap sebesar 68,33% dan 59,61%. Setelah 2 jam inkubasi dalam buffer sitrat-fosfat (pH 7,0), aktivitas enzim tetap 100%. Penambahan 10 mM MgSO₄ dan CuSO₄ meningkatkan aktivitas enzim masing-masing sekitar 21% dan 35%, sedangkan NaCl, MnCl₂, KCl, dan CaCl₂ menghambat aktivitas enzim. Dengan menggunakan ABTS sebagai substrat, parameter kinetik (Km dan Vmax) laccase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 masing-masing adalah 1,99 mM dan 16.217 μmol min−1 L−1. Perlakuan enzimatik pada sampel jus apel secara signifikan mengurangi pH dan viskositas, dan pengurangan ini berkorelasi dengan peningkatan waktu penyimpanan. Perlakuan laccase menghasilkan sedikit penurunan kandungan fenolik total jus apel, tetapi tidak ada penurunan aktivitas antioksidan yang diamati.
Dalam beberapa tahun terakhir, para peneliti telah memfokuskan perhatian pada penerapan bioteknologi hijau di industri pangan. Laccase adalah salah satu enzim yang paling bermanfaat di industri pangan, yang banyak digunakan di berbagai bidang seperti pengolahan jus, pembuatan roti, stabilisasi anggur, dan peningkatan kualitas organoleptik produk makanan.¹Banyak tumbuhan tingkat tinggi dan mikroorganisme mengeluarkan lakase,²dan jamur seperti deuteromycetes, ascomycetes, dan basidiomycetes juga dapat menghasilkan laccase.³Laccase (EC 1.10.3.2) adalah oksidase biru yang mereduksi oksigen molekuler menjadi air menggunakan sistem yang terdiri dari tiga atom tembaga yang berbeda, sehingga mengoksidasi berbagai senyawa fenolik dan amina aromatik. Selama produksi jus buah dan sayuran, pencoklatan enzimatik dan non-enzimatik merupakan masalah kritis.⁴Karena zat-zat ini berdampak negatif pada warna, rasa, dan aroma jus, maka zat-zat tersebut harus dihilangkan.⁵
Dari semua buah-buahan, apel adalah yang paling banyak dikonsumsi di seluruh dunia dan di Uni Eropa. Pada tahun 2019, produksi apel menempati peringkat ketiga secara global, melebihi 87 juta ton.⁶Apel mengandung banyak senyawa fenolik, termasuk flavonoid dan asam fenolik seperti asam kafeik dan asam klorogenik.⁷Karena jus apel biasanya dikonsumsi dalam bentuk jernih, sekitar 50% hingga 90% komponen fenolik hilang selama proses penyaringan.⁸Saat ini, konsumen cenderung memilih produk yang diproses seminimal mungkin, seperti jus apel keruh dengan kandungan polifenol tinggi. Namun, karena kandungan fenoliknya yang tinggi, jenis jus apel ini sangat rentan terhadap perubahan warna dan penggelapan.⁹Berbagai teknologi, termasuk metode perlakuan panas seperti pasteurisasi pada suhu 60–90°C, digunakan untuk mengurangi atau mencegah penggelapan warna jus apel.¹⁰Namun menurut penelitian Sauceda-Gálvez¹¹Pengolahan termal dapat merusak bahan kimia yang mudah menguap dan memengaruhi kualitas organoleptik jus apel. Alternatif untuk metode pengolahan termal meliputi karbon dioksida superkritis, radiasi ultraviolet, ultrasonik, tekanan hidrostatik tinggi, atau homogenisasi tekanan tinggi.¹²Efisiensi teknologi ini dan hasil jus buah yang sesuai bergantung pada parameter yang digunakan dan karakteristik produk. Penggunaan luasnya dibatasi oleh biaya yang tinggi, efek buruk pada kualitas beberapa produk makanan, atau inaktivasi enzim yang tidak memadai.^13,14
Laccase dapat digunakan untuk menstabilkan dan menjernihkan jus buah.¹⁵Gökmen dkk.¹⁶Disarankan menggunakan laccase untuk penjernihan jus buah karena secara efektif menghilangkan senyawa fenolik dengan mengubahnya menjadi polimer atau oligomer yang mudah dihilangkan oleh membran ultrafiltrasi apa pun, sehingga jus apel dapat mempertahankan warna dan kejernihan yang stabil hingga enam minggu pada suhu 50°C. Laccase *Trichoderma* yang dimurnikan diimobilisasi pada manik-manik alumina dan digunakan untuk secara selektif menghilangkan senyawa penyebab rasa tidak sedap yang disebabkan oleh kontaminasi mikroba pada jus apel.¹⁷
Sekitar 80-90% komponen volatil dalam jus apel adalah ester dan aldehida, yang memberikan aroma unik pada jus tersebut.¹⁸Laccase dari *Trametes versicolor* diimobilisasi pada penyangga murah yang terbuat dari serat alami dari tempurung kelapa muda untuk penjernihan jus apel.¹⁹Penelitian sebelumnya telah menyelidiki stabilisasi jus apel (warna dan kekeruhan) menggunakan metode tanpa enzim atau metode imobilisasi, atau dikombinasikan dengan ultrafiltrasi.^5,19Namun, pengaruh lakase jamur terhadap sifat fisikokimia jus apel selama penyimpanan masih belum jelas. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk menyelidiki secara eksperimental perubahan sifat fisikokimia, kandungan senyawa fenolik, dan aktivitas antioksidan jus apel setelah perlakuan dengan lakase jamur dan penyimpanan dingin selama dua minggu. Lakase memiliki kemampuan untuk mengoksidasi senyawa fenolik, yang membuatnya menjanjikan untuk digunakan dalam berbagai proses industri, termasuk penjernihan jus. Penelitian ini meneliti lakase dari *Pleurotus ostreatus* NRC 620, dengan fokus pada kondisi ideal untuk aktivitas dan efektivitasnya dalam penjernihan jus. Meskipun penelitian tentang jamur tiram (P. ostreatus NRC 620) masih terbatas, penelitian sebelumnya telah meneliti enzim dari berbagai sumber jamur, seperti Trametes versicolor dan Ganoderma lucidum. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi potensi aplikasi enzim ini dalam industri makanan dan menyoroti sifat uniknya, khususnya pH dan suhu idealnya.
2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) dibeli dari Sigma-Aldrich (Kanada). Semua reagen lainnya memiliki kualitas analitik.
Pusat Koleksi Kultur Mikroba Pusat Penelitian Nasional memperoleh strain jamur tiram NRC620 yang sudah dikenal. Setelah subkultur, strain ini disimpan pada media agar kentang dekstrosa miring pada suhu 4°C. Metode persiapan inokulum adalah sebagai berikut: miselium berumur 10 hari yang telah berkembang penuh diinokulasikan ke piring agar kentang dekstrosa dan diinkubasi pada suhu 28°C. Setelah 10 hari, tiga blok miselium berdiameter 12 mm diambil dari media agar menggunakan alat pelubang logam steril dan ditempatkan dalam labu Erlenmeyer 250 mL dengan sumbat kapas yang berisi 50 mL media kultur steril (pH 5,0, seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Othman dkk.).²⁰Kultur diinkubasi pada suhu 28°C selama 18 hari. Kemudian, kultur disaring menggunakan kertas saring Whatman No. 1, dan supernatan yang dihasilkan digunakan sebagai sumber enzim.
Aktivitas lakase ditentukan menggunakan ABTS sebagai substrat. Campuran reaksi (2 mL) mengandung 500 μL ABTS 0,3 mM (dilarutkan dalam buffer natrium sitrat 0,1 M, pH 4,5) dan jumlah sampel enzim yang dibutuhkan yang diencerkan dengan air suling.^21,22Mengingat bahwa lakase dapat mengoksidasi ABTS pada suhu ruang (28 °C ± 2), oksidasi ABTS ditentukan dengan mengukur peningkatan absorbansi pada 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1) menggunakan spektrofotometer UV Agilent Carry-100. Satu unit aktivitas lakase diperlukan untuk mengoksidasi 1 μmol ABTS per menit. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan albumin serum sapi sebagai kontrol internal.^23,24
Setelah memperoleh enzim dari strain jamur tiram NRC 620, aktivitasnya diukur pada interval budidaya yang berbeda selama 25 hari dalam kondisi statis pada suhu 28 °C.
Untuk mempelajari pengaruh suhu terhadap aktivitas lakase, percobaan dilakukan pada kisaran suhu 20 hingga 90 °C. Sebelum menambahkan enzim dan memulai reaksi, larutan penyangga (natrium sitrat 0,1 M, pH 4,5) dan substrat (ABTS) dicampur dan diinkubasi selama 5 menit pada berbagai suhu. Stabilitas termal enzim dinilai dengan inkubasi dalam larutan penyangga natrium fosfat 0,05 M (pH 7,0) pada suhu 40, 50, 60, dan 70 °C selama 2 jam. Aktivitas residual kemudian dinilai menggunakan substrat ABTS.
Pengaruh pH terhadap aktivitas lakase dinilai menggunakan ABTS sebagai substrat dalam larutan penyangga sitrat-fosfat 0,1 M dengan rentang pH 2,5 hingga 7,0. Larutan enzim diinkubasi pada suhu 40°C selama dua jam dalam larutan penyangga sitrat dan Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6, dan 7) untuk menilai stabilitas pH. Aktivitas residual dengan ABTS sebagai substrat dihitung setelah inkubasi.
Laccase diinkubasi selama 10 menit dalam larutan buffer natrium fosfat (0,05 M, pH 7,0) yang mengandung berbagai ion logam (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, dan Mn2+) dengan konsentrasi masing-masing 2,5 mM dan 10 mM. Substrat (ABTS) kemudian ditambahkan untuk memulai reaksi, dan aktivitas relatifnya dinilai.
Oksidasi ABTS oleh lakase pada berbagai konsentrasi (0,025–3 mM) diukur pada pH 4,5 untuk menentukan parameter kinetik (Vmax dan Km). Kinetik tersebut^konstantaKonstanta kinetik persamaan Michaelis-Menten dihitung menggunakan plot Lineweaver-Burk, yang memplot kebalikan dari laju reaksi sebagai fungsi konsentrasi substrat. Konstanta kinetik dihitung dari plot Lineweaver-Burk menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism versi 6.01.
Setelah apel dicuci bersih dengan air keran, apel dipotong menjadi dua dan diperas menggunakan alat pemeras jus apel otomatis Braun MP80 (buatan Jerman). Jus disaring melalui empat lapis kain kasa. Tidak ada enzim yang ditambahkan ke kelompok kontrol, sedangkan 2,0% lakase (konsentrasi paling efektif yang diuji) ditambahkan ke jus apel yang baru disiapkan, yang kemudian disimpan pada suhu 4°C selama dua minggu.
Keasaman titrasi (TA) dan pH ditentukan menurut metode Boulton et al.^al.27pH setiap sampel diukur menggunakan pH meter digital (pH meter JENWAY 3510). Keasaman titrasi (TA) dihitung berdasarkan asam malat menggunakan rumus berikut.
Di mana V dan C masing-masing adalah volume (mL) dan konsentrasi (0,1 mol/L) larutan natrium hidroksida yang digunakan dalam titrasi. K adalah koefisien konversi asam malat, sama dengan 0,067, dan W adalah massa (g) jus apel.
Total padatan terlarut (^TDSKandungan (H2O) dari semua sampel jus ditentukan menggunakan refraktometer saku PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Jepang). Setelah setiap pengukuran, lensa optik dibilas dengan air deionisasi, dan setiap sampel jus apel diuji tiga kali. Nilai untuk setiap sampel dihitung dengan merata-ratakan ketiga pengukuran tersebut. Rata-rata ± standar deviasi untuk setiap sampel jus apel juga dihitung dengan merata-ratakan hasil tersebut.
Viskoelastisitas sampel jus apel dinilai menggunakan viskometer putar (RV, Rheotest 2, Jerman). Sampel ditempatkan di dalam silinder “S2” viskometer. Viskositas semu diwakili oleh kemiringan kurva tegangan geser versus laju geser, yang dihitung dari tegangan geser dan kurva yang sesuai pada berbagai laju geser (dari 1,00 hingga 437,4 s⁻¹). Rumus untuk menghitung viskositas semu adalah sebagai berikut:
Di mana η adalah viskositas semu (cP), τ adalah tegangan geser (dyn/cm²), γ adalah laju geser (sec⁻¹), dan (τ) dihitung menggunakan nilai torsi (α) dan silinder (Z) dengan menggunakan rumus berikut: τ = Z . α.
Indeks pengcoklatan ditentukan menurut metode Meidav ​​et^al.29Sampel jus sebanyak 10 ml disentrifugasi pada 2750 xg selama 10 menit. 5 ml supernatan jus dicampur dengan 5 ml etanol 95%. Absorbansi campuran diukur pada 420 nm menggunakan spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Kandungan fenolik total (TPC) ditentukan secara kolorimetri menggunakan reagen Folin-Ciocalteu seperti yang dijelaskan oleh Boulton dkk.^[27Kurva standar asam galat dibuat untuk konsentrasi dari 0 hingga 500 mg/L (^r²= 0,997). Hasil dinyatakan sebagai setara asam galat (mg GAE/mL).
Tambahkan 125 μL air suling dan 2850 μL larutan FRAP ke dalam 25 μL jus apel dan biarkan campuran tersebut di tempat gelap selama³⁰Kemudian ukur absorbansi pada 593 nm menggunakan spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC). Reagen FRAP disiapkan dengan mencampur buffer asetat 300 mM (pH 3,6), besi(III) klorida 20 mM, dan 2,4,6-tris(2-piridil)triazin (TPTZ) 10 mM (dilarutkan dalam HCl 40 mM) dengan rasio 10:1:1. Kurva standar dibuat menggunakan Trolox sebagai standar (^R²= 0,999), dan hasilnya dinyatakan dalam μM Trolox/mL.
Aktivitas antioksidan dari jus yang diolah dan tidak diolah ditentukan menggunakan metode DPPH untuk mengevaluasi kemampuannya dalam menangkal radikal bebas DPPH.³¹Sepuluh mikroliter jus dicampur dengan 1 ml larutan DPPH (100 μM) dalam metanol. Setelah reaksi dalam gelap selama 30 menit, absorbansi campuran diukur pada 517 nm menggunakan spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC). Hasil dinyatakan sebagai setara trolox (μM trolox/ml) berdasarkan kurva kalibrasi (_^R2= 0,990).
Data yang diperoleh menunjukkan bahwa produksi lakase maksimum diamati pada jamur tiram NRC 620 pada akhir hari ke-18 fermentasi, mencapai aktivitas 1302 U/L. Hal ini menjadi dasar untuk menentukan waktu budidaya optimal untuk produksi lakase (Gambar 1). Meskipun produksi enzim meningkat seiring dengan peningkatan waktu budidaya, laju peningkatannya tidak berbanding lurus dengan waktu budidaya; setelah 21 hari, aktivitas enzim hanya meningkat sebesar 90 U/L (menjadi 1390 U/L). Oleh karena itu, 18 hari akhirnya dipilih sebagai waktu budidaya optimal untuk menyeimbangkan hasil produk dengan manfaat ekonomi dari peningkatan waktu budidaya.
Pengaruh waktu kultivasi terhadap hasil lakase pada Pleurotus ostreatus NRC 620. Tiga blok miselium jamur (12 mm) diinokulasi ke dalam 50 ml media steril dan kemudian dikultur pada suhu 28 °C selama waktu yang berbeda.
Sesuai dengan penelitian lain, hasil kami menunjukkan bahwa periode kultur ideal untuk mencapai puncak sekresi lakase oleh jamur kemungkinan berada antara 7 dan 36 hari.³²Menurut Ezike dkk.³³*Trametes polyzona* WRF03 menghasilkan jumlah lakase tertinggi pada akhir hari kesembilan fermentasi, dengan aktivitas spesifik sebesar 1637 U/mg protein. Selanjutnya, Othman dkk.³⁴Ditemukan bahwa *Trichoderma harzianum* S7113 mengeluarkan sejumlah besar lakase pada hari kelima kultur. Tingkat produksi lakase mencapai puncak aktivitas pada hari keempat belas dan kemudian secara bertahap menurun.³⁴Meskipun sekresi enzim juga dapat terjadi selama fase pertumbuhan utama, biasanya puncaknya terjadi selama fase menengah dan dipicu oleh konsumsi sumber karbon atau nitrogen.^34,35
Meskipun lakase dari Pleurotus ostreatus NRC 620 menunjukkan aktivitas tinggi pada rentang suhu yang luas dari 50°C hingga 80°C, mendekati aktivitas puncak (69–98%), aktivitas maksimumnya diamati pada 70°C (Gambar 2a). Di luar rentang suhu ini, aktivitas enzim menurun pada suhu sekitar 70°C. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim aktif pada suhu tinggi, kemungkinan karena suhu tinggi meningkatkan energi kinetik reaksi.
Pengaruh suhu reaksi (a) dan pH (b) terhadap aktivitas lakase pada *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Suhu berkisar antara 20 hingga 90 °C dicapai dengan pra-inkubasi campuran pada suhu yang berbeda selama 5 menit sebelum menambahkan enzim dan memulai reaksi. Pengaruh pH terhadap aktivitas lakase dinilai menggunakan ABTS sebagai substrat dalam larutan yang mengandung buffer sitrat-fosfat 0,1 M pada kisaran pH 2,5 hingga 7,0.
Menurut Yehezkiel^al.33, suhu optimal untuk laccase *Trametes polyzona* WRF03 adalah 55 °C, yang sama dengan suhu optimal untuk *Ganoderma lucidum*.^lakase36dan serupa dengan suhu optimal (50 °C) untuk *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lakase . ^Baldrian38mencatat bahwa, seperti halnya sistem enzim pengurai lignin lainnya, kisaran suhu ideal untuk lakase adalah antara 50 dan 70 °C.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim tersebut menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 3,0, mencapai 94% aktivitas pada pH 3,5. Namun, enzim tersebut tetap aktif pada rentang pH yang luas dari 2,5 hingga 7,0 (Gambar 2b). Lebih lanjut, enzim tersebut menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi dalam kondisi asam dibandingkan dengan kondisi netral atau basa. Aktivitasnya tetap minimal 77% pada rentang pH dari 2,5 hingga 4,5, tetapi hanya mencapai sekitar 38% pada pH 7,0. pH optimum untuk lakase dari *Trametes polyzona* WRF03 adalah 4,533, yang sama dengan pH untuk lakase dari *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, dan *Trametes hirsuta* 41. Namun, menurut penelitian oleh Chairin dkk.⁴²pH optimal untuk lakase dari *Polymorpha f. sp.* WR710-1 adalah 2,2, sedangkan pH optimal untuk lakase dari *Polymorpha f. sp.* IBL-04 adalah 5,043. Pengikatan anion hidroksida (inhibitor lakase) ke atom tembaga lakase T2/T3 mungkin menjadi alasan penurunan aktivitas lakase pada kondisi pH netral atau basa. Hal ini dapat mengganggu transfer elektron internal dari pusat T1 ke pusat T2/T3, sehingga^membatasiaktivitas enzim23,44
Dengan menginkubasi enzim pada suhu yang berbeda, ditemukan bahwa baik waktu inkubasi maupun suhu memengaruhi stabilitas enzim. Secara khusus, lakase dari *Trametes polyzona* NRC 620 menunjukkan stabilitas yang lebih tinggi pada suhu 40℃ dan 50℃, mempertahankan 68,33% dan 59,61% dari aktivitas awalnya, masing-masing, setelah 120 menit (Gambar 3a). Sebaliknya, dalam kondisi yang sama (40℃ dan 50℃, 120 menit), lakase dari *Trametes polyzona* WRF03 mempertahankan 64,38% dan 42,92% dari aktivitasnya, masing-masing.³³Sebaliknya, peningkatan waktu inkubasi dan suhu menurunkan stabilitas lakase *Trametes polyzona* NRC 620; Setelah inkubasi pada suhu 60℃ dan 70℃ selama 60 menit, aktivitasnya menurun masing-masing menjadi 39,24% dan 1,72% (Gambar 3a). Konsisten dengan hasil eksperimen, lakase dari *Trametes polyzona* WRF03 menunjukkan stabilitas yang lebih tinggi pada suhu 40 dan 50℃ selama proses perlakuan termal.³³Demikian pula, Lueangjaroenkit et^al.37dan Chairin et^al.42melaporkan stabilitas lakase dari Trametes polyzona KURNW027 dan Trametes polyzona WR710-1 pada suhu 50 °C selama 1 jam. Sebagai biokatalis yang berguna dan dapat diaplikasikan di berbagai bidang bioteknologi, lakase harus memiliki stabilitas dan kinerja yang baik pada rentang suhu yang luas.
Stabilitas termostatik (a) dan stabilitas pH (b) lakase dari *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Stabilitas termostatik dinilai dengan menginkubasi larutan enzim dalam buffer natrium fosfat 0,05 M (pH 7,0) pada suhu 40, 50, 60, dan 70 °C selama 2 jam. Stabilitas pH dinilai dengan menginkubasi larutan enzim dalam buffer sitrat 0,1 M dan buffer Tris (pH 3, 4, 6, dan 7) pada suhu 40 °C selama 2 jam. Aktivitas residual dihitung menggunakan ABTS sebagai substrat setelah inkubasi.
Untuk menentukan kondisi optimal penggunaan dan penyimpanan enzim, kami menyelidiki pengaruh pH terhadap stabilitas lakase. Paparan terhadap berbagai nilai pH secara signifikan memengaruhi stabilitas struktur protein, sehingga memengaruhi stabilitas dan aktivitas molekul enzim. Hasil menunjukkan bahwa enzim kurang stabil dalam kondisi asam, sedangkan menunjukkan stabilitas yang lebih baik pada nilai pH yang lebih tinggi (wilayah netral dan basa). Pada nilai pH 7,0, 6,0, 4,0, dan 3,0, tingkat retensi enzim setelah 120 menit masing-masing sekitar 100%, 62,54%, 52,39%, dan 11,14% (Gambar 3b). Laccase *Strombus multisus* WRF03 menunjukkan stabilitas yang lebih tinggi pada nilai pH netral (5,5–6,5) dan stabilitas yang lebih rendah pada nilai pH asam (di bawah 4,0). Setelah 120 menit pada nilai pH 5,5, 6,0, dan 6,5, tingkat retensi enzim masing-masing sekitar 82%, 100%, dan 93%.³³Khairin dkk.⁴²mencatat bahwa laccase dari Trametes polyzona WR710-1 stabil pada kisaran pH 6,0 hingga 7,0, sedangkan Sayed et al.⁴⁵menunjukkan bahwa lakase lebih stabil pada kondisi pH netral. Namun, lakase dari Cerrena unicolor juga menunjukkan stabilitas pada kondisi basa (pH 9,0).⁴⁶Laccase yang diteliti menunjukkan stabilitas tinggi pada rentang pH yang luas. Ini mungkin merupakan karakteristik penting untuk aplikasi industri.
Karena beberapa ion logam memiliki efek stimulasi dan penghambatan terhadap aktivitas enzim, pengaruhnya terhadap aktivitas enzim harus dipertimbangkan dalam aplikasi industri. Hal ini sangat penting karena ion logam merupakan kontaminan lingkungan umum yang dapat memengaruhi stabilitas dan sintesis enzim ekstraseluler.⁴⁷Untuk menyelidiki pengaruh beberapa ion logam terhadap lakase dari *Pleurotus ostreatus* NRC 620, kami melakukan percobaan yang sesuai. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, tergantung pada jenis logam yang digunakan, peningkatan konsentrasi ion logam dari 2,5 mM menjadi 10 mM berdampak negatif terhadap fungsi enzim. Misalnya,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, Dan^Cu²⁺dapat merangsang dan mengaktifkan aktivitas enzim, sementara^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, Dan^K⁺dapat menghambat aktivitas enzim. Pada konsentrasi 10 mM, ion Cu²⁺ dan Mg²⁺ merupakan aktivator aktivitas lakase yang paling ampuh dari *Pleurotus ostreatus* NRC 620, memberikan tingkat aktivasi masing-masing sekitar 34% dan 20%. Namun, pada konsentrasi 10 mM, ion Ca²⁺ merupakan penghambat lakase yang paling ampuh, mengurangi aktivitas enzim sekitar 60%.
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas lakase Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakase diinkubasi selama 10 menit dalam larutan penyangga natrium fosfat (0,05 M, pH 7,0) yang mengandung berbagai ion logam dengan konsentrasi 2,5 mM dan 10 mM. Reaksi kemudian dimulai dengan penambahan substrat (ABTS), setelah itu aktivitas relatif diukur.
Hasil kami konsisten dengan hasil penulis lain yang menemukan bahwa Mg²⁺ dan Cu²⁺ meningkatkan aktivitas *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño dkk.⁴⁸ menemukan bahwa lakase dari *Xylaria* sp. dirangsang sampai batas tertentu oleh ion tembaga (Cu²⁺). Lebih lanjut, Foroutanfar dkk.⁴⁹ dan Si dkk.⁵⁰ melakukan studi serupa pada lakase dari *Paraconiothyrium variabile* dan *Trametes pubescens*, masing-masing. Situs pengikatan tembaga tipe II (T2) dari enzim ini dapat dijenuhkan dengan Cu²⁺ pada konsentrasi tertentu, yang mungkin menjelaskan stimulasi aktivitas lakase pada konsentrasi Cu²⁺³⁹ yang lebih tinggi. Karena lakase jamur pelapuk putih merupakan oksidase yang mengandung banyak atom tembaga, efek ion tembaga pada aktivitas lakase beragam dan berkisar dari stimulasi dan penghambatan hingga netral.⁵¹ Sebaliknya, Zhou et al^[52]melaporkan bahwa^Cu²⁺menghambat aktivitas lakase rayap bawah tanah Taiwan (Odontotermes formosanus). Namun, lakase dari Cerena sp. HYB07^[53]dan Clitocybe maxima^[54]tidak terpengaruh oleh ion tembaga.
Spesifisitas substrat diwakili oleh parameter kinetiknya (Km dan Vmax); semakin kuat afinitas pengikatan substrat terhadap enzim, semakin rendah nilai Km dan semakin tinggi spesifisitas substrat.^3,21,55Parameter kinetik (Km dan Vmax) lakase dari *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ditentukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 6.0 dengan memplot grafik Lineweaver-Burk (Gambar 5). Ketika menggunakan ABTS sebagai substrat, hasilnya adalah 1,99 mM dan 16217 μmol^{menit⁻¹ L⁻¹,}masing-masing. Elsayed dkk.²¹Dilaporkan bahwa nilai Km untuk oksidasi ABTS masing-masing adalah 0,1 mM dan 0,064 mM, yang menunjukkan afinitas tinggi isoenzim Lac A dan Lac B terhadap ABTS. Selanjutnya, nilai Vmax adalah 0,182 μmol.^menit⁻¹dan 0,603 μmol^menit⁻¹, masing-masing. Nilai Km yang diperoleh lebih rendah daripada Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); selanjutnya, nilai Vmax mereka (1429 mmol min⁻¹) juga^{lebih rendah}ketika menggunakan ABTS sebagai substrat.33 Demikian pula, nilai Km dari konsentrasi laccase Lentinus squarrosulus MR13 dan Trametes sp. AH28-2 masing-masing adalah 0,0714 mM dan 0,025 mM, dan nilai Vmax masing-masing adalah 0,0091 mM min−1 dan 0,67 mM min−1 mg−1 (relatif terhadap ABTS)^{, masing-masing.56,57}
Pengaruh konsentrasi ABTS terhadap aktivitas lakase dari *Pleurotus ostreatus* NRC 620 diselidiki, dan plot Lineweaver-Burk dari kebalikan kecepatan reaksi awal terhadap konsentrasi ABTS diplot. Reaksi oksidasi ABTS dengan berbagai konsentrasi (0,025–3,0 mM) lakase diukur pada pH 4,5 untuk menentukan parameter kinetik (Vmax dan Km). Konstanta kinetik Michaelis-Menten dihitung menggunakan plot Lineweaver-Burk dari kebalikan kecepatan reaksi terhadap konsentrasi substrat. Konstanta kinetik dihitung dari plot Lineweaver-Burk menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 6.01.
Enzim penjernih tradisional, seperti pektinase, menghidrolisis zat pektin, mengurangi viskositas dan kekeruhan. Enzim ini efektif memecah polisakarida struktural dan sering digunakan dalam kombinasi dengan enzim lain, seperti selulase dan hemiselulase, untuk meningkatkan hasil dan kejernihan. Namun, pektinase tidak secara spesifik menargetkan senyawa fenolik, yang merupakan kontributor utama kekeruhan dan pencoklatan oksidatif, terutama pada jus seperti jus apel dan anggur.⁵⁸Sebaliknya, lakase mengkatalisis oksidasi senyawa fenolik, mempolimerisasikannya menjadi molekul yang lebih besar dan tidak larut yang dapat dihilangkan dengan sedimentasi atau filtrasi. Mekanisme ini tidak hanya meningkatkan kejernihan tetapi juga memperpanjang umur simpan jus dengan mengurangi kemungkinan terjadinya pengcoklatan oksidatif yang disebabkan oleh senyawa fenolik. Lebih lanjut, proses penjernihan berbasis lakase dapat dilakukan dalam kondisi pemrosesan yang ringan (pH 3,5–5,5, suhu 25–40 °C), sehingga cocok untuk jus yang lembut tanpa mengorbankan sifat nutrisi atau organoleptiknya.⁵⁹Penelitian menunjukkan bahwa perlakuan pektinase dapat menjernihkan jus dalam 1–2 jam, sedangkan perlakuan lakase biasanya membutuhkan waktu reaksi yang lebih lama (3–6 jam) untuk sepenuhnya mengurangi senyawa fenolik. Namun, proses ini dapat dioptimalkan dengan mengimobilisasi enzim atau dengan menggabungkan lakase dengan metode penjernihan mekanis.⁶⁰Dalam penelitian ini, profil enzim dari ekstrak kasar menunjukkan aktivitas lakase dan α-amilase yang signifikan, sedangkan aktivitas pektinase dan xilanase sangat rendah, dan aktivitas selulase tidak terdeteksi. Oleh karena itu, penurunan kekeruhan dan kandungan fenolik terutama disebabkan oleh kerja lakase, sedangkan perubahan viskositas sebagian dapat disebabkan oleh kerja amilase.
Tabel 1 menunjukkan parameter fisikokimia jus apel segar dan sampel yang diberi perlakuan lakase. Hasil menunjukkan bahwa rendemen jus apel segar (71,59%) lebih rendah daripada sampel yang diberi perlakuan lakase (87,34%). Hasil ini konsisten dengan temuan Pilnik dan Orange.⁶¹, yang menunjukkan bahwa penggunaan enzim dalam pengolahan buah dapat meningkatkan hasil sari buah, memperbaiki penyaringan, dan menghasilkan sari buah berkualitas tinggi dan jernih untuk konsentrasi. Peningkatan hasil sari buah terutama disebabkan oleh peningkatan kandungan gula larut dalam sari buah. Selama hidrolisis enzimatik buah, mesoglea dan pektin di dinding sel produk dihancurkan dan diubah menjadi zat larut seperti gula netral dan asam.^62.Nilai pH jus apel yang diolah dengan enzim secara signifikan lebih rendah daripada kelompok kontrol (P < 0,05), dan nilai pH kedua kelompok meningkat secara signifikan selama penyimpanan (Tabel 1). Hasil ini konsisten dengan hasil penelitian Mark et al.⁶³, yang mencatat bahwa pH jus buah jambu mete menurun setelah penyimpanan setelah perlakuan panas. Degradasi pektin dan pembentukan asam galakturonat setelah perlakuan enzim mungkin bertanggung jawab atas peningkatan pH selama penyimpanan. pH sampel yang diberi perlakuan enzim tetap berada antara 4,05 dan 4,31 sepanjang penyimpanan, sedangkan pH jus apel yang tidak diberi perlakuan berkisar antara 4,12 dan 4,33.
Total keasaman (TA) dari sampel yang tidak diolah dan yang diolah dengan lakase menunjukkan tren penurunan seiring dengan peningkatan waktu penyimpanan (Tabel 1). Penurunan keasaman tersebut disebabkan oleh konversi asam organik menjadi karbohidrat atau reaksi enzimatik, serta oksidasi selama penyimpanan jus.⁶⁴Total keasaman jus apel kontrol dan sampel yang diberi perlakuan enzim lebih rendah daripada jus lainnya (jus stroberi 0,9%, jus plum 2,2%, jus kumquat 1,0%, jus aprikot 2,4%, jus jeruk 0,8%), tetapi mirip dengan jus lainnya (misalnya, jus pir 0,3%).⁶²Perbedaan pada jus apel segar yang tidak diolah ini mungkin disebabkan oleh berbagai faktor seperti kondisi pertumbuhan, faktor genetik, tingkat kematangan, dan metode pengolahan.⁶⁵Penurunan total keasaman jus apel kontrol dan yang diberi perlakuan lakase konsisten dengan hasil yang disajikan oleh Singh et al.⁶⁶mengenai penurunan total keasaman jus apel Jin Nuo setelah 74 hari penyimpanan. Di sisi lain, Oshmiansky dan Wojdylo⁶⁷tidak menemukan perubahan signifikan pada keasaman jus apel ketika mempelajari pengaruh metode penjernihan tradisional.
Hasil yang disajikan dalam Tabel 1 menunjukkan bahwa nilai total padatan terlarut (TSS) jus apel yang diberi perlakuan lakase lebih tinggi daripada sampel yang tidak diberi perlakuan. Hasil ini konsisten dengan penelitian yang telah dipublikasikan.⁶⁸Selanjutnya, Tabel 1 menunjukkan bahwa nilai TSS kelompok jus apel kontrol adalah 9,58 pada titik waktu awal dan mencapai 11,05 pada akhir periode penyimpanan. Nilai-nilai ini lebih rendah daripada nilai TSS jus apel segar yang dilaporkan oleh Hamid et al.⁶⁹(masing-masing 11,2 dan 11,80). Nilai TSS sampel jus apel yang diberi perlakuan lakase meningkat secara signifikan, dimulai dari 11,23 dan mencapai 12,93 setelah dua minggu penyimpanan pada suhu 4°C (Tabel 1). Peningkatan TSS serupa selama penyimpanan juga diamati pada buah jeruk, lemon, dan jeruk manis. Peningkatan total padatan terlarut (TSS) selama penyimpanan mungkin disebabkan oleh hidrolisis polisakarida (pati) menjadi monosakarida (gula), peningkatan konsentrasi karena dehidrasi jus, dan degradasi pektin dalam jus menjadi padatan terlarut. Peningkatan total padatan terlarut (TSS) kemungkinan disebabkan oleh peningkatan gula terlarut, yang mungkin terbentuk melalui konversi pektin atau selulosa menjadi gula terlarut oleh pektin atau selulase, atau melalui hidrolisis pati menjadi gula, seperti yang dilaporkan oleh Hamed dkk.^69.Pengaruh lakase terhadap sifat-sifat jus apel dapat diamati secara visual, karena jus apel yang diberi perlakuan lakase menunjukkan daya alir yang lebih baik dan viskositas yang lebih rendah dibandingkan jus yang tidak diberi perlakuan. Pengamatan ini tercatat dalam Tabel 1; Viskositas sampel yang diberi perlakuan enzim adalah 1,87 cP, sedangkan viskositas sampel kontrol adalah 2,95 cP. Penurunan viskositas yang signifikan ini kemungkinan disebabkan oleh kapasitas penahan air yang lebih tinggi dari zat-zat mirip pektin dan pembentukan struktur jaringan yang kohesif.
Dalam penelitian ini, pengaruh lakase terhadap indeks pencoklatan (BI) jus apel diselidiki dengan mengukur absorbansi pada 420 nm menggunakan spektrofotometer. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1. Selama penyimpanan, BI sampel jus apel baik pada kelompok yang diberi perlakuan maupun yang tidak diberi perlakuan menunjukkan tren peningkatan bertahap. BI mencerminkan tingkat pencoklatan dan dapat berfungsi sebagai^{sebuah hal penting}Indikator reaksi pencoklatan enzimatik dan non-enzimatik. Absorbansi meningkat secara signifikan selama penyimpanan (P < 0,05). Pada akhir penyimpanan,_A420Nilai sampel jus apel pada kelompok kontrol dan kelompok yang diberi perlakuan enzim meningkat masing-masing sekitar 217% dan 121% (Tabel 1). Hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan enzim dapat secara efektif mengurangi tingkat pengcoklatan sekitar 56%. Hasil penelitian Bezerra dkk.^[19] konsisten dengan hasil kami; Mereka menggunakan laccase-glutaraldehid-serat kelapa untuk menjernihkan jus apel, mengurangi warna aslinya hingga 61%.
Meskipun polifenol dalam jus buah memiliki efek nutrisi dan terapeutik yang positif bagi tubuh manusia, polifenol juga dapat bereaksi dengan protein, menyebabkan jus menjadi keruh, mengendap, atau berubah warna, sehingga mengubah rasa dan aroma produk serta mengurangi umur simpannya.⁷¹Tujuan penelitian ini adalah untuk mengurangi kandungan senyawa fenolik dalam jus apel secara aman menggunakan lakase dari Pleurotus ostreatus NRC 620. Hasil yang disajikan pada Tabel 1 menunjukkan bahwa kandungan total senyawa fenolik dalam jus apel yang diolah dengan lakase berkurang secara signifikan sebelum penyimpanan pada suhu 4 °C. Selanjutnya, kandungan total senyawa fenolik juga menurun selama penyimpanan pada kedua sampel yang diteliti (Tabel 1). Penelitian oleh Sandri dkk.⁷²menunjukkan bahwa jus apel yang diolah dengan enzim dapat mempertahankan aktivitas antioksidan dan kandungan senyawa fenoliknya. Namun, hasil penelitian oleh Lettera dkk.⁷³menunjukkan bahwa pengolahan jus jeruk dengan lakase jamur dapat mengurangi kandungan senyawa fenolik di dalamnya hingga 45%.
Senyawa fenolik telah terbukti memiliki sifat-sifat seperti penangkapan radikal bebas, reduksi dan pemadaman oksigen singlet, transfer atom hidrogen, dan donasi elektron ke radikal bebas, sehingga menjadikannya antioksidan yang ampuh.⁷⁴Oleh karena itu, dalam penelitian ini, metode berbasis DPPH dan FRAP digunakan untuk mengevaluasi pengaruh lakase terhadap aktivitas antioksidan jus apel yang disimpan dalam lemari es selama 14 hari (Tabel 2). Kedua metode tersebut menunjukkan peningkatan aktivitas antioksidan selama penyimpanan, yang mungkin disebabkan oleh peningkatan senyawa fenolik bebas atau pembentukan produk reaksi Maillard (MRP), dengan produk reaksi Maillard kemungkinan besar menjadi penyebab peningkatan aktivitas antioksidan.⁷⁵Reaksi pencoklatan non-enzimatik (termasuk degradasi asam askorbat, reaksi Maillard, dan degradasi gula yang dikatalisis asam) menghasilkan pigmen cokelat (melanoidin). Produk degradasi asam askorbat dan produk degradasi gula (seperti senyawa karbonil) dapat bereaksi dengan asam amino melalui reaksi Maillard.⁷⁶Meskipun proses perubahan warna buah dan sayuran menjadi cokelat selama penyimpanan telah banyak dipelajari, pemahaman kita tentang reaksi-reaksi ini masih terbatas.⁷⁷Dibandingkan dengan metode FRAP, jus apel yang diolah dengan lakase menunjukkan aktivitas antioksidan yang secara signifikan lebih rendah dengan metode DPPH (Tabel 2), dan aktivitas antioksidan semua sampel meningkat secara signifikan seiring bertambahnya waktu penyimpanan. Dua metode berbeda untuk menentukan aktivitas antioksidan digunakan dalam penelitian ini karena prinsipnya berbeda. Metode DPPH mengukur kemampuan untuk menetralkan radikal bebas, sedangkan metode FRAP mengukur kemampuan untuk mereduksi ion besi. Oleh karena itu, disarankan untuk menggunakan beberapa metode untuk menentukan aktivitas antioksidan guna memahami aktivitas antioksidan sampel yang diteliti dengan lebih baik.⁷⁸
Salah satu temuan kunci dari penelitian ini adalah bahwa lakase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 menunjukkan aktivitas optimal pada suhu 70°C dan pH 3,0. Dibandingkan dengan lakase jamur lain yang umum digunakan untuk penjernihan jus, seperti lakase *Trametes versicolor* dan *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 menunjukkan stabilitas termal yang lebih tinggi dan pH yang lebih asam. Lakase dari *Trametes versicolor* dan *Ganoderma lucidum* biasanya menunjukkan aktivitas optimal dalam kisaran 50-60°C dan pada nilai pH antara 3,5 dan 5,0. Perbedaan ini dapat berkontribusi pada peningkatan efisiensi penjernihan jus, terutama untuk jus asam di mana stabilitas pada nilai pH yang lebih rendah sangat penting. Karakteristik unik dari *P. Dibandingkan dengan lakase jamur lain yang telah dipelajari, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 menunjukkan kemampuan untuk berfungsi secara efektif dalam kondisi yang lebih menantang. Suhu aktivitas optimalnya yang lebih tinggi menunjukkan potensi keuntungan dalam aplikasi industri, seperti laju reaksi yang lebih cepat dan pengurangan kontaminasi mikroba. pH-nya yang rendah, yang sangat cocok dengan sifat asam dari banyak jus, mungkin berguna dalam proses penjernihan jus. Hasil ini membenarkan eksplorasi lebih lanjut untuk aplikasi skala besar, menjadikan *Pleurotus ostreatus* NRC 620 sebagai alternatif yang layak untuk sumber lakase jamur tradisional. Dibandingkan dengan penelitian sebelumnya, kami menemukan bahwa suhu optimal adalah 60°C dan pH optimal adalah 3,0. Setelah reaksi pada suhu 60°C selama 80 menit, lakase *Ganoderma lucidum* tetap aktif.⁴⁶% dari aktivitasnya.79 Menurut Kurniawati dan Nicelle⁸⁰Enzim *Ganoderma lucidum* menunjukkan stabilitas yang sangat baik hingga sedang pada suhu 25°C dan nilai pH berkisar antara 5,0 hingga 8,0, serta stabilitas pada pH 6,0 dan suhu berkisar antara 10 hingga 30°C. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa pH dan suhu optimum untuk aktivitas enzim *Pleurotus ostreatus* masing-masing adalah 3,0 dan 70°C. Setelah inkubasi pada suhu 40°C dan 50°C selama dua jam, enzim tersebut mempertahankan 68,33% dan 59,61% aktivitasnya, masing-masing. Lebih lanjut, lakase Pleurotus ostreatus NRC 620 menunjukkan aktivitas tinggi pada rentang suhu yang luas dari 50°C hingga 80°C, hampir mencapai aktivitas maksimum (69%–98%), dengan aktivitas maksimum diamati pada suhu 70°C.
Kesimpulannya, lakase jamur tiram NRC620, yang diperoleh dalam kondisi statis, menunjukkan aktivitas dan stabilitas optimal di berbagai kondisi pH dan suhu, menunjukkan stabilitas yang lebih unggul dibandingkan dengan sumber enzim lainnya. Penambahan 10 mM MgSO₄ dan CuSO₄ meningkatkan aktivitas enzim masing-masing sekitar 21% dan 35%. Ketika diolah menjadi jus apel, enzim tersebut menurunkan pH dan viskositas, sementara kandungan fenolik hanya sedikit menurun selama penyimpanan.
Hasil penelitian ini menegaskan potensi laccase dalam industri makanan, khususnya dalam penjernihan minuman. Dengan secara spesifik memecah senyawa fenolik, laccase tidak hanya mengurangi kekeruhan dan meningkatkan kejernihan, tetapi juga mempertahankan kualitas jus buah dalam kondisi operasi yang ringan. Tidak seperti bahan penjernih tradisional seperti gelatin, bentonit, dan silika gel, laccase tidak menghasilkan limbah atau menghilangkan aroma yang menyenangkan dari minuman, menjadikannya pilihan yang lebih ramah lingkungan dan berkelanjutan. Selain itu, dibandingkan dengan enzim dan metode filtrasi lainnya, laccase menawarkan solusi yang tepat sasaran dan hemat biaya tanpa mengorbankan kualitas produk.
Kyomuhimbo, HD dan Brink, HG. Aplikasi dan strategi imobilisasi lakase yang mengandung tembaga; sebuah tinjauan. Heliyon 9, e13156 (2023).